隆到任何载体的任何位置。ABKhifi Seamless Cloning Kit是将载体线性化处理，在插入片段两端引入
载体两端的15-25个碱基的同源序列，按照一定比例混合后加入重组Mix混合反应，即可完成连接反应，
转化后可以筛选阳性克隆。该产品具有反应时间短、连接效率高，抗干扰能力强的特点。
使用该方法克隆，用来线性化载体的酶切位点在拼接的时候会丢失，如对酶切位点有严格要求，建议注意酶切
位点的选择，必要时可在克隆引物的重叠区序列和特异基因序列之间增加缺失掉的碱基来恢复原有酶切位点。举例
说明如下：
A．正向引物设计（EcoR I酶切）：
载体末端20 bp重叠序列
EcoR I酶切后末端
5’—
GGTATGCGAGCCTAGGTGAGTTGGCCG
—3’
3’—
CCATACGCTCGGATCCACTCAACCGGCTTAA — 5’
如上图，载体用EcoR I酶切，形成5’突出末端，根据引物设计原则，从3’端开始计算16-25 bp（本例为
20 bp末端重叠序列），加到目的片段特异引物序列5’端即可。确保重叠区域的Tm值保持一致且＞60°C。正
向引物具体如下：
5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
注：以上引物设计完成克隆连接后，EcoR I 酶切位点将会消失（不保留酶切位点）。
如需保留EcoR I酶切位点，需要在载体末端20 bp重叠序列和目的片段特异引物序列之间补齐缺失的EcoR I
识别位点序列aattc，完成克隆连接后，EcoR I酶切位点依然存在（保留酶切位点）。具体如下：
5'— GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattcNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
B．反向引物设计（Hind III酶切开）：
5’— AGCTTGCGAACGATCCGATGGCAGATACG
— 3’
3’—
ACGCTTGCTAGGCTACCGTCTATGC
— 5’
Hind III酶切后末端
载体末端20 bp重叠相同序列
如上图，载体用Hind III酶切，形成5’突出末端，根据引物设计原则，从3’端开始计算16 -25 bp（本例
为20 bp末端重叠序列），加到目的片段特异引物序列5’端即可。确保重叠区域的Tm值保持一致且＞60°C。
反向引物具体如下：
5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'
注：以上引物设计完成克隆连接后，Hind III切位点将会消失（不保留酶切位点）。
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